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發布時間: 2017 - 07 - 18
Drop Maker 樣本制備儀采用光、機、電一體化設計,配套具有自主知識產權的微流控芯片,可以將水相樣本快速制備成納升體積的液滴。液滴數與樣本體積相關,30微升樣本可制備約5萬個液滴。液滴尺寸均一,并可在PCR擴增后保持穩定。產品說明起始樣本量(μL)20-50制備通量1-8個樣本制備時間4min / 8樣本每 30 μL 樣本液滴數約50000個儀器尺寸(寬 ´ 深 ´ 高)38 x 34 x 35 cm
發布時間: 2017 - 07 - 18
Chip Reader 生物芯片閱讀儀采用光、機、電一體化設計,及激光共聚焦原理,配套有自主知識產權的微流控芯片,可以準確快速地定位、識別納升體積微液滴,獲取其熒光信號值。經過泊松統計分析,提供研究者所需的陽性、陰性液滴數絕對數值,從而推算出起始靶標核酸分子的精確濃度。Chip Reader  生物芯片閱讀儀兼容Taqman水解探針和EVAGreen檢測。產品說明閱讀通道FAM(EvaGreen)、VIC(HEX)閱讀通量1-8個樣本閱讀時間20min / 8樣本儀器尺寸(寬 ´ 深 ´ 高)45 x 47 x 49 cm
發布時間: 2017 - 08 - 14
數字PCR耗材分為微液滴樣本制備通用試劑盒(包含微液滴生成芯片、微液滴生成油、微液滴生成芯片密封墊、8聯排管及8聯排管蓋),以及微液滴檢測通用試劑盒(包含微液滴檢測芯片、微液滴檢測油及微液滴檢測芯片密封墊),用于配套Drop Maker 樣本制備儀,將水相溶液樣本制備為納升體積液滴,并通過Chip Reader 生物芯片閱讀儀對微液滴進行定量檢測。產品說明起始樣本量(μL)20-50芯片通量8個樣本池(可單獨使用)
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數字PCR在移植排斥監控中的應用

日期: 2018-11-23
瀏覽次數: 321

數字PCR在移植排斥監控中的應用

器官移植是治療器官衰竭的最佳方法之一,對于末期器官病變患者更是唯一有效的治療方式。常見移植器官包括心臟、肺臟、肝臟、腎臟、胰臟和小腸。據統計,2017年我國實施器官移植手術超過1.6萬例,隨著公民逝世后自愿捐獻例數不斷增加,器官移植手術量呈逐年上升趨勢,移植手術的質量也大幅提升。然而,移植排斥反應仍然是這一領域的一大難題,是導致移植手術失敗的重要原因。器官移植后,由于供、受者之間的組織抗原不同,移植物刺激受者的免疫系統發生免疫應答,引發排斥反應。樹突狀細胞(DC)在免疫應答過程中提呈抗原,激活受體T細胞,T細胞對同種異體移植物識別并活化,介導免疫應答,通過多種機制破壞、殺傷移植物(圖一)。


數字PCR在移植排斥監控中的應用

圖一:移植排斥反應機制(來源:Ayala-García MA, et al. (2012) “The Major Histocompatibility Complex?

in Transplantation”.?Journal of transplantation.)

數字PCR在移植排斥監控中的應用

雖然免疫抑制劑的使用可以避免排斥反應的發生從而增加移植物的存活率,但是它們大多具有一些副作用,應盡可能減少其用量。因此,術后監控,特別是對移植排斥的監控,對于器官移植受者的長期存活至關重要。通過監測患者的術后狀態,可以為其設計個性化的治療方案,從而避免過多的使用免疫抑制劑,同時,亦可為高反應患者提供足夠的藥物來控制排斥反應,進一步提高手術的成功率和存活率。目前臨床上用于監控移植排斥的“金標準”為侵入式的組織活檢,通過組織病理學來確認存在的損傷類型和程度。然而,組織活檢存在這些問題:可能導致相關組織受損、引起并發癥、具有取樣誤差、費用昂貴。因此,此方法不適合用于持續監控患者狀況以及時調整治療方案。


近年來,研究人員在受者血液和尿液中發現了供者來源的游離DNA(donor-derived cell-free DNA, ddcfDNA),這些ddcfDNA隨著移植物中的細胞壞死或凋亡而釋放出來,若受者的免疫系統對移植物產生排斥反應,則ddcfDNA的水平將居高不下。由此可見,ddcfDNA可作為排斥反應的標記物,對其水平進行監控可提示受者術后的健康狀況(圖二)。然而,ddcfDNA僅占受者血液和尿液中游離DNA的一小部分,如何分辨出ddcfDNA及對其進行精確的定量無疑是一大挑戰。





數字PCR在移植排斥監控中的應用






圖二:ddcfDNA作為排斥反應標記物(來源:https://www.elsevier.com/about/press-releases/research-and-

journals/new-non-invasive-assay-may-improve-surveillance-of-heart-and-other-solid-organ-transplants)

數字PCR在移植排斥監控中的應用

其中,最直接的方式是以Y染色體作為供者的標記物進行檢測,適用于女性受者與男性供者的移植監控。Sigdel等人2利用數字PCR(dPCR)檢測63例腎臟移植女性受者的尿液樣本中的Y染色體(供者為男性)。實驗結果顯示,急性排斥(AR)與BK病毒性腎病(BKVN)受者尿液中的Y染色體含量顯著高于穩定移植(STA)與慢性移植物損傷(CAI)受者的Y染色體含量(圖三)。由此說明Y染色體ddcfDNA可作為一種移植排斥監控的生物標記物。但是,該策略僅限于約25%的移植人群,其臨床應用受到限制。

數字PCR在移植排斥監控中的應用

:移植患者尿液樣本中Y染色體dPCR檢測結果?2

數字PCR在移植排斥監控中的應用

適用性更廣的方法是利用遺傳多態性來進行ddcfDNA的定量,例如可以通過受者和供者的單核苷酸多態性(SNP)來確定ddcfDNA的百分比。Beck等人3設計了41個探針組,選取合適的SNP位點(受者為純合子、供者為雜合子或與受者不同的純合子)并利用微液滴數字PCR(ddPCR)對其進行檢測,最終確定ddcfDNA的含量。結果表明,進行肝臟、腎臟和心臟移植且情況穩定的患者,ddcfDNA含量分別小于6.8%,2.5%和3.4%,而出現排斥反應的患者ddcfDNA含量超過60%。


目前報道的文獻中用于檢測ddcfDNA的技術主要有三種,分別是實時熒光定量PCR(qPCR)、dPCR和NGS法,它們的靈敏度、成本及檢測時間的比較如下:

檢測技術

靈敏度

精準定量

成本

檢測時間

qPCR

+++

++

$

dPCR

++++

++++

$$

6 h

NGS

++++

++++

$$$

>5天

dPCR作為一種高靈敏度、能夠實現絕對定量的技術,比之qPCR更適合用于含量較低的ddcfDNA的定量,其檢測結果更準確。雖然NGS法也有較高的靈敏度,但其儀器成本與技術門檻較高,且耗時較長,不適合在一般臨床實驗室開展。綜合來看,dPCR可能更適合應用于臨床進行移植排斥的監控,這種非侵入式的監控方式能夠解決上述傳統方法存在的問題,提高移植的成功率及存活率,令人期待。


參考文獻:

  1. Gielis EM,?et al.?(2015) “Cell-Free DNA: An Upcoming Biomarker in Transplantation”.?American Journal of Transplantation.

  2. Sigdel TK,?et al.?(2013) “A Rapid Noninvasive Assay for the Detection of Renal Transplant Injury”.?Transplantation.

  3. Beck J,?et al.?(2013) “Digital Droplet PCR for Rapid Quantification of Donor DNA in the Circulation of Transplant Recipients as a Potential Universal Biomarker of Graft Injury”.?Clinical Chemistry.



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